Rab35 kit承诺守信「武汉纽斯特」

1.抗活性Arf 6，小鼠单克l隆抗l体（货号26918）：一小瓶– 22 μL（1

含50％甘油和0.05％叠氮l化钠的PBS（pH 7.4）中的浓度（mg / ml）。 该抗l体特异性识别所有脊椎动物的Arf 6-GTP。

2.蛋白A / G琼脂糖（目录号30301）：一小瓶– 400 μL 50％浆液。

3. 5X测定/裂解缓冲液（目录号30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mM N***，50 mM MgCl2，5 mM EDTA，5％Triton X-100。

4.抗Arf 6，兔多克l隆抗l体（货号21032）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）

pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。

5. 100 XGTPγS（目录号30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγS标记0.5 mL细胞裂解液。

6. 100 X GDP（产品目录号30304）：一个样品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP标记0.5 mL细胞裂解物。

武汉纽斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美国生命科学***供应商美国NewEastBio在中国的子公司。公司位于武汉东湖高新技术开发区光谷生物城.美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA***盒、蛋白等，与世界高校和研究所、世界大制药公司、生物科技公司和***等客户建立了长期稳定的合作关系，产品销往各地。

悬浮细胞

1.培养细胞并根据需要用活化剂或***l剂刺激。

2.进行细胞计数，然后通过离心沉淀细胞。

3.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。

4.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞沉淀物中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液（每1 x 107个细胞0.5 – 1 mL）。

5.通过重复移液裂解细胞。

***制备

1X Assay/Lysis Buffer：实验前用去离子水将5X的Assay/Lysis缓冲液稀释成1X的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶***l剂如1 mM PMSF, 10 μg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 μg/mL aprotinin（抑肽酶）。

样品处理

贴壁细胞

1. 培养细胞密度达到大约80%-90%之间（直径10 cm培养皿，~107个细胞），并用活性剂或***l剂进行处理。

2. 吸去培养基并用冰冷的PBS洗涤两次。

3. 向细胞中加入1X Assay/Lysis缓冲液（每个直径10cm的***培养皿中加入0.5-1mL）。

4. 将培养皿放置于冰上处理10-20分钟。

5. 用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。

6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。

7. 如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用27?的***l器针头来回吸取3-4次，以******组DNA，从而避免上述情况的出现。

8. 4°C 12000 g, 离心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg总蛋白）并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°C条件下。

检测步骤

Ι。活性Cd***2 Pull-Down实验

1. 等分0.5-1 mL的细胞裂解物至微量离心管中。

2. 向管中加入1mL的1X Assay/Lysis 缓冲液。

3. 向管中加入1ul的活性Cd***2单克l隆抗l体。

4. 用涡旋振荡仪将protein A/G凝胶柱充分混匀，然后快速的吸出20ul悬浮珠浆液加入离心管中。

5. 将管置于4°C条件下孵育1H，并轻轻的进行摇动。

6. 5000g，离心1分钟。

7. 弃上清，这一步要非常小心以避免珠子的损失。

8. 用0.5 mL的1X Assay/Lysis缓冲液洗涤珠子三次，离心并弃去上清。

9. 后一次洗涤后，小心的移去所有的上清。

10. 用20ul的2X SDS-PAGE样品缓冲液重悬样品。

11. 样品煮沸5min。

12. 5000g，离心10s。