Gao-GTP纽斯特「武汉纽斯特」

1.刺激的和非刺激的细胞裂解液

2.蛋白酶抑l制剂

3. 4°C管摇杆或摇床

4. 0.5 M EDTA，pH8.0

5. 1 M氯化镁

6. 2倍还原SDS-PAGE样品缓冲液

7.电泳和免l疫印迹系统

8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M N***，0.05％

吐温20）

9.免l疫印迹封闭缓冲液（TBST包含5％脱脂奶粉或3％BSA）

10. PVDF或硝l酸纤维素膜

11.二抗

12. ECL检测***

武汉纽斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美国生命科学***供应商美国NewEastBio在中国的子公司。美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA***盒、蛋白等。

悬浮细胞

1.培养细胞并根据需要用活化剂或***l剂刺激。

2.进行细胞计数，然后通过离心沉淀细胞。

3.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。

4.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞沉淀中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液

   （每1 x 107池0.5 – 1 mL）。

5.通过重复移液裂解细胞。

6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。

7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果这

   发生时，裂解液可通过27?号***l器针头3-4次以剪切

   ***组DNA。

8.通过离心10分钟（在4°C下为12,000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用，或速冻并保存在-

   70°C以备将来使用。

阳性和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量

    注意：体内刺激细胞会激l活大约10％的可用Rab35，而

    体外GTPγS蛋白负载将激l活近90％的Rab35。

1.将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Rab35蛋白）。

2.向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（至20 mM终浓度）。

3.将5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。

4.在第二个试管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，终浓度）（阴性对照）。

5.在搅拌下将试管在30°C孵育30分钟。

6.通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM）。

Arl1激l活试验。纯化的GST标记的Arl1蛋白用抗活性Arl1单克l隆抗l体（Cat。#26924）用GDP（车道1）或GTPγS（车道2）处理后，用抗Arl1单克l隆抗l体（Cat）进行印迹。#26056年）。显示Arl1蛋白输入控制在底部面板中。

产品描述

Arf样蛋白1（Arl1）是调节性gtpase家族中的一员，位于Ras中GTPases的超家族，在真核生物中具有高度保守的同源***。Arl1至关重要用于果蝇和秀丽隐杆线虫的早期胚胎发育。Arl1在一级序列，细胞位置和功能（膜交通的调节）到Arf1–6甚至共享几个共同的有约束力的合作伙伴。除了在膜交通中的作用高尔基/跨高尔基网络，有报道表明Arl1可能在离子稳态中起作用酵母。

目前还没有直接测定Arl1-gtpase活性的方法。NewEast Biosciences Arl1激l活检测***盒是基于特定构型的单克l隆抗l体特异性识别Arl1 GTP，但不识别Arl1 GDP的抗l体。鉴于单克l隆抗l体对其抗原，活化试验可在短时间内进行。这个分析结果可靠，重现性一致。

分析原理

基于构型特异性抗Gα13-GTP的NewEast生物科学Gα13活化检测***盒从细胞提取物或体外检测活性Gα13-GTP水平的单克l隆抗l体GTPγS负载Gα13活化试验。简单地说，抗活性Gα13小鼠单克l隆抗l体用含有Gα13-GTP的细胞裂解液培养。结合的活性Gα13将被蛋白质A/G琼脂糖。用兔抗α13多克l隆抗l体免l疫印迹法检测沉淀的活性Gα13。